In generale, ai fini della canonizzazione, la Chiesa cattolica ritiene necessario un secondo miracolo, dopo quello richiesto per la beatificazione: nel caso di Padre Pio, ha ritenuto miracolosa la guarigione di Matteo Pio Colella, un bambino di sette anni nato a San Giovanni Rotondo. Il 20 gennaio 2000, mentre era a scuola, Matteo si sentì male: fu portato a casa, ma nella serata la situazione precipitò e il padre, urologo dell'ospedale 'Casa Sollievo della Sofferenza', lo accompagnò al pronto soccorso dello stesso ospedale, dove fu diagnosticata una meningite fulminante. Ricoverato in rianimazione, il 21 gennaio Matteo ebbe un edema polmonare acuto e non si riusciva più a rilevare la pressione arteriosa; successivamente collassarono nove organi; i medici emisero una prognosi infausta, non avendo mai registrato guarigioni in pazienti con più di cinque organi compromessi, secondo la casistica riportata nella letteratura medica internazionale.
In favore del bambino si sviluppò una catena di preghiere rivolte a Padre Pio, a cominciare dai genitori, devoti del frate. La madre riferì di aver avuto una visione di Padre Pio, e la stessa cosa riferì Matteo una volta uscito dal coma. Contrariamente a qualsiasi ragionevole previsione, il bambino cominciò a migliorare, e il 25 febbraio fu dimesso. Dopo un altro mese di terapie riabilitative poté riprendere la scuola, con un successivo completo recupero psicofisico. La Consulta medica della Congregazione delle cause dei santi, il 22 novembre 2001, dichiarò che

"La guarigione, rapida, completa e duratura, senza postumi, era scientificamente inspiegabile".

Il decreto sul presunto miracolo fu promulgato il 20 dicembre 2001 alla presenza di Papa Giovanni Paolo II, che procedette alla canonizzazione il 16 giugno 2002.